Metodi rapidi per la determinazione di patogeni

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Negli ultimi anni si sono verificate numerose epidemie causate da patogeni alimentari, anche in paesi avanzati nei quali l’implementazione del sistema HACCP nella filiera agroalimentare è ormai ben radicata. La caratteristica inquietante di alcune di queste epidemie è costituita dal fatto che patogeni dei quali si pensava di conoscere bene le caratteristiche e i substrati alimentari tipici in cui sospettarne la presenza, hanno invece dimostrato comportamenti anomali e imprevedibili. Ne sono esempi le vaste epidemie di Salmonellosi verificatesi negli Stati Uniti in anni recenti, nelle quali il batterio è stata in grado di contaminare substrati alimentari considerati “inospitali” quali il burro di arachidi (ad elevatissimo tenore lipidico e scarso contenuto di acqua) e vari vegetali (tra cui pomodori freschi e spinaci, nei quali il batterio non è solo in grado di sopravvivere ma anche di proliferare, pur non essendo un patogeno vegetale). In Europa è recentissima e ancora in atto l’epidemia di epatite A causata da frutti di bosco, altro substrato certamente atipico. Altri patogeni, come per es. L’Escherichia coli, un batterio innocuo presente nell’intestino di molti mammiferi uomo compreso, hanno originato alcuni ceppi patogeni dotati di elevata virulenza (come per es. O157:H7) produttori di tossine nefrotossiche ed epatotossiche particolarmente pericolose, e potenzialmente fatali, per bambini e anziani. In un recente caso che ha coinvolto numerosi Paesi europei, l’alimento carrier, individuato con molta fatica e ritardo nonostante vi lavorassero in contemporanea vari laboratori ed istituzioni, si è scoperto essere costituito da germogli freschi contaminati dal batterio. Per alcuni di questi patogeni sono allo studio strumenti di lotta radicali quali la somministrazione di vaccini agli animali portatori (per es. pollame nel caso di Salmonella e bovini nel caso di Escherichia), ma nel frattempo è di fondamentale importanza poterne determinare la presenza negli alimenti in maniera rapida ed affidabile, soprattutto nel corso di epidemie che necessitano di rapida identificazione dell’alimento contaminato al fine di evitare ulteriore diffusione. I metodi micro-biologici tradizionali, quali la conta su piastra in seguito ad inoculazione su terreno selettivo e crescita delle colonie, sono complessi e richiedono numerosi giorni di lavoro prima di ottenere i risultati. Di seguito sono esposti metodi innovativi che hanno il vantaggio di essere molto più rapidi e spesso anche più selettivi e affidabili.
Arachidi
Determinazione rapida di batteri
Tra i metodi rapidi più vantaggiosamente utilizzati vi sono:
PCR-RT (polymerase chain reaction real time): questa insostituibile tecnologia di biologia molecolare ha avuto un enorme sviluppo negli ultimi decenni, grazie alla sua capacità di moltiplicare in modo esponenziale specifici frammenti di materiale genetico, in modo poi da poterli facilmente identificare e quantificare. Le applicazioni sono numerosissime, per es. il riconoscimento di specie (sia vegetali che animali) al fine di smascherare frodi alimentari. Negli ultimi anni si sta applicando sempre più vantaggiosamente anche all’identificazione della presenza di patogeni: sono ormai numerosi in commercio i kit (per es. per Salmonella, Listeria monocytogenes, Escherichie produttrici di tossine, etc.) contenenti frammenti genetici specifici di quel determinato ceppo patogeno. Spesso primers e probes sono forniti già adesi ai pozzetti di test, garantendo semplicità di utilizzo e sensibilità del dato analitico. Controlli negativi e controlli di inibizione, necessari all’affidabilità del risultato, sono anch’essi già presenti all’interno dei kit analitici. Esistono addirittura alcuni kit in grado di rilevare contemporaneamente più di un patogeno. Unica pecca della PCR rispetto ai metodi classici su piastra: l’incapacità di discriminare tra batteri morti (per es. derivanti da una pregressa contaminazione di un ingrediente prima della cottura) e batteri vivi in fase di proliferazione.
Biosensori: stanno suscitando un crescente interesse, non solo per la rilevazione di microrganismi ma anche per quella di contaminanti chimici (per es. pesticidi, farmaci veterinari, micotossine, metalli pesanti). Sono caratterizzati da elevata specificità, semplicità di utilizzo e risposte estremamente rapide. Esistono numerosi tipi di biosensori, a seconda della tecnica di immobilizzazione (anticorpi, fagi, matrici, etc.), della tecnologia utilizzata (i biosensori ottici sono tra i più diffusi) e della tecnica di rilevazione dei microrganismi (sfruttando per es. le loro proprietà elettrochimiche, biochimiche o fisiche). Esistono biosensori per i maggiori patogeni alimentari tra cui Salmonella, Listeria, E. Coli e Campylobacter, e anche biosensori in grado di rilevare la presenza di tossine batteriche (per es. tossina botulinica ed enterotossina B stafilococcica) con sensibilità elevate. I test di bioluminescenza, basati sulla rilevazione della luce generata da interazioni enzimatiche nel caso di presenza di batteri, sono tra i più rapidi esistenti. Sono già adottati in varie aziende alimentari per verificare l’efficacia dei processi di sanificazione, per es. test di monitoraggio igienico basati sulla rilevazione di ATP microbico, in grado di fornire non solo una riposta sì-no ma anche un certo grado di quantificazione della popolazione microbica. In un articolo scientifico recentissimo gli autori descrivono il biosensore magnetoelastico da essi sviluppato, in grado di determinare la presenza di Salmonelle (e in futuro anche di altri patogeni) sulla superficie degli alimenti: in prospettiva potrebbe diventare un dispositivo non solo utilizzabile in tutte le varie fasi della filiera produttiva, ma anche per es. da inserire in tablet e smartphone, pronto per essere utilizzato prima di accomodarsi a tavola: nella propria cucina, a casa di amici, al bar o nei ristoranti, diventando un valido strumento alla portata di tutti.

FOH2165Determinazione rapida di virus
Pur essendo la maggioranza di patogeni alimentari di natura batterica, vi sono anche alcuni virus particolarmente temibili, tanto da essere considerati tra le cause più frequenti di malattie trasmissibili con gli alimenti in Europa. Tra i più diffusi vi sono il Norovirus (di recente responsabile della contaminazione di ostriche in Francia, agosto 2013) e il virus dell’epatite A. Quest’ultimo ha dato origine negli ultimi mesi ad una lunga serie di problematiche legate al consumo di frutti di bosco surgelati. I primi casi sono stati segnalati nel Nord Europa alla fine del 2012, poi anche in Italia, soprattutto a partire dall’estate 2013, si sono iniziati a contare decine di casi di consumatori colpiti da epatite A in seguito al consumo di frutti di bosco surgelati non cotti prima del consumo. Si ipotizza che la fonte di contaminazione possa essere l’acqua di lavaggio utilizzata, oppure quella aggiunta durante la surgelazione. Nonostante siano già passati numerosi mesi dall’inizio dell’epidemia, la fonte di contaminazione non è ancora certa poiché i mix di frutti di bosco contengono frutti diversi, spesso provenienti da zone o addirittura da Paesi diversi. L’epatite A è una patologia quasi sempre non cronicizzante ma comunque piuttosto seria, che affianca ai classici sintomi gastrointestinali anche il danno epatico. Nel caso dei virus il ricorso alla loro determinazione tramite microbiologia classica (utilizzando cioè terreni di coltura) è ancora più laborioso poiché i virus sono parassiti endocellulari obbligati, quindi per verificarne la presenza è necessario coltivare cellule specifiche e adatte alla loro proliferazione. Anche in questo caso però sono disponibili metodi di biologia molecolare che permettono rilevazioni molto più semplici e rapide, quali la PCR-RT.

Determinazione rapida di muffe e lieviti
Anche per quanto riguarda muffe e lieviti i metodi classici di crescita su substrati selettivi sono lenti e laboriosi rispetto, anche a causa della crescita particolarmente lenta di muffe e lieviti. È ora in commercio un test rapido che, pur essendo basato su inoculazione e conta su piastra come i metodi classici, permette la loro determinazione in 48 ore anziché 5-7 giorni. È inoltre applicabile ad una grande varietà di alimenti, indipendentemente dal loro contenuto di acqua. Muffe e lieviti possono essere determinati assieme o separatamente.

Bibliografia
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Rita Lorenzini

1 COMMENTO

  1. Spett.le Rita Lorenzini
    Per quanto riguarda test rapidi di lieviti e muffe le saremmo grati di conoscere queste aziende , che producono questi test,siamo una piccola azienda che produce batteriologia clinica e alimentare per ampliare il nostro catalogo saremmo interessati ad un rapporto commerciale grazie

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